Pregabaliin ei ole GABAA ega GABAB retseptori agonist.
Pregabaliin on gabapentinoid ja toimib teatud kaltsiumikanaleid inhibeerides.Täpsemalt on see teatud pingest sõltuvate kaltsiumikanalite (VDCC) α2δ abisubühiku saidi ligand ja toimib seega α2δ subühikut sisaldavate VDCC-de inhibiitorina.On kaks ravimit siduvat α2δ subühikut, α2δ-1 ja α2δ-2, ning pregabaliinil on sarnane afiinsus nende kahe saidi suhtes (ja seega selektiivsuse puudumine).Pregabaliin on selektiivne seondumisel α2δ VDCC subühikuga.Hoolimata asjaolust, et pregabaliin on GABA analoog, ei seondu see GABA retseptoritega, ei muutu in vivo GABA-ks ega muuks GABA retseptori agonistiks ega moduleeri otseselt GABA transporti ega metabolismi.Siiski on leitud, et pregabaliin suurendab annusest sõltuvat L-glutamiinhappe dekarboksülaasi (GAD) aju ekspressiooni, ensüümi, mis vastutab GABA sünteesimise eest, ja seetõttu võib sellel olla kaudne GABAergiline toime, suurendades GABA taset ajus.Praegu puuduvad tõendid selle kohta, et pregabaliini toimet vahendaks mõni muu mehhanism peale α2δ-sisaldavate VDCC-de inhibeerimise.Vastavalt sellele näib, et α2δ-1 sisaldavate VDCC-de inhibeerimine pregabaliini poolt on vastutav selle krambivastase, valuvaigistava ja anksiolüütilise toime eest.
Endogeensed α-aminohapped L-leutsiin ja L-isoleutsiin, mis sarnanevad keemiliselt väga pregabaliini ja teiste gabapentinoididega, on α2δ VDCC subühiku näilised ligandid, millel on sarnane afiinsus kui gabapentinoididel (nt IC50 = 71 nM L- jaoks isoleutsiin) ja neid leidub inimese tserebrospinaalvedelikus mikromolaarsetes kontsentratsioonides (nt L-leutsiini puhul 12,9 µM, L-isoleutsiini puhul 4,8 µM).On teoretiseeritud, et need võivad olla alaühiku endogeensed ligandid ja et nad võivad konkureerivalt antagoniseerida gabapentinoidide toimet.Vastavalt sellele, kuigi gabapentinoididel, nagu pregabaliin ja gabapentiin, on nanomolaarne afiinsus α2δ subühiku suhtes, on nende tugevus in vivo madalas mikromolaarses vahemikus ja väidetavalt on selle lahknevuse põhjuseks tõenäoliselt konkurents endogeensete L-aminohapetega seondumise pärast.

Ühes uuringus leiti, et pregabaliinil on 6 korda suurem afiinsus kui gabapentiinil α2δ subühikut sisaldavate VDCC-de suhtes.Teises uuringus leiti aga, et pregabaliinil ja gabapentiinil oli sarnane afiinsus inimese rekombinantse α2δ-1 subühiku suhtes (Ki = vastavalt 32 nM ja 40 nM).Igal juhul on pregabaliin valuvaigistina 2–4 ​​korda tugevam kui gabapentiin ja loomadel näib see olevat 3–10 korda tugevam kui gabapentiin krambivastase ainena.